Testes genéticos em diagnóstico pré-natal: onde estamos, para onde vamos / Prenatal genetic testing: where we are at, where we are heading to

Este texto tem como objetivo apresentar uma revisão acerca do estado da arte da citogenética convencional e molecular aplicada ao diagnóstico pré-natal, discutindo as aplicações, vantagens e desvantagens dos diferentes métodos, em suas bases teóricas e históricas. Desde 1960, a citogenética convencional, com a análise microscópica dos cromossomos em divisão, vem sendo utilizada como padrão ouro. Entretanto, mesmo adotando essa abordagem, para uma significativa parcela de casos não é possível estabelecer diagnóstico sindrômico definitivo em cerca de metade dos pacientes que apresentam cariótipo normal, na presença de malformações. Para esse grupo, as técnicas moleculares que envolvem estudos em nível genômico poderiam permitir a identificação de novos microarranjos cromossômicos possivelmente responsáveis pelo fenótipo anormal, contribuindo para a caracterização molecular e estabelecimento de um diagnóstico mais preciso, uma abordagem perinatal mais adequada e um aconselhamento genético mais detalhado. Destaca-se o advento das técnicas de FISH, SKY, CGH e array CGH como promissoras aliadas, de forma complementar ao cariótipo convencional

This paper aims at presenting a review of the state of the art of conventional and molecular cytogenetics applied to prenatal diagnosis, the applications, pros and cons of different techniques and their historical and theoretical background. Since 1960, conventional cytogenetics, based on the analysis of chromosomes has been used as a gold standard. However, for a significant proportion of cases it is not possible to establish definitive syndromic diagnosis in about half of the patients with normal karyotype in the presence of malformations. For this group, molecular techniques at the genomic level might allow the identification of new chromosomal areas potentially responsible for the abnormal phenotype, contributing to the molecular characterization and establishment of a more accurate diagnosis and the most appropriate perinatal approach, including a more detailed genetic counseling. The advent of FISH techniques, SKY, CGH and array CGH will be discussed as promising tools to complement cytogenetic diagnosis based on conventional karyotyping

O intervalo de tempo entre coleta e processamento do sangue de cordão umbilical influencia na qualidade da amostra? / Does the time between collecting and processing umbilical cord bloodsamples affect the quality of the sample?

Objective: To assess the association between the time from umbilical cord blood collection until processing and the quality of the sample. Methods: Umbilical cord blood samples collected during the third stage of labor were placed in temperature-controlled boxes for the transport of biological material and sent to an umbilical cord blood bank, where the number of nucleated cells, viable cells and CD34+ cells were counted, and samples were additionally tested for contamination at the following time intervals: up to 24 hours, up to 48 hours and up to 72 hours following sampling. Data were analyzed using the multivariate analysis of variance (MANOVA) and compared using McNemar's X2 test. Significance was defined at p < 0.05. Results: Means and medians of the number of nucleated cells, viable cells and CD34+ cells decreased significantly (p < 0.0001) as a function of the increased time between sampling and analysis, the difference between 24 and 48 hours being less than the difference between 24 and 72 hours. A linear correlation was found between the mean number of viable cells and CD34+ cells at the three moments of analysis. Contamination testing was negative in all samples. Conclusion: The increase in time interval from sampling until analysis negatively affected the number of nucleated cells, viable cells and CD34+ cells but was not associated with specimen contamination. A linear correlation was found between decrease in the number of viable cells and CD34+ cells.

Objetivo: Avaliar a associação do intervalo de tempo entre coleta e processamento do sangue de cordão umbilical e a qualidade da amostra. Métodos: As amostras de sangue de cordão umbilical, colhidas no terceiro período do parto, foram acondicionadas em caixas homologadas para transporte de material biológico, com monitoração da temperatura, e enviadas a um banco de sangue de cordão umbilical, onde foram submetidas à contagem do número de células nucleadas, do número de células viáveis, do número de células CD 34+ e pesquisa de contaminação, nos intervalos de tempo de até 24, até 48 e até 72 horas. Os dados foram analisados pelo teste de variância para medidas repetidas MANOVA e comparados por meio do teste do X2 de Mc Nemar, considerando-se nível de significância de 5%. Resultados: As médias e as medianas do número de células nucleadas, número de células viáveis e número de células CD34+ tiveram quedas significativas (p < 0,0001) com o aumento do intervalo de tempo de coleta/processamento, sendo entre 24 e 48 horas menor do que a comparação entre 24 e 72 horas. Constatada correlação linear entre as médias de células viáveis e células CD34+ nos três momentos da análise. A pesquisa de contaminação foi negativa em todas as amostras. Conclusão: O aumento do intervalo de tempo de coleta/processamento influenciou negativamente na contagem de células nucleadas, células viáveis e CD34+ e não esteve associado à contaminação das amostras. Foi constatada correlação linear entre a queda do número de células viáveis e de células CD34+.

Genomic imbalances detected through array CGH in fetuses with holoprosencephaly / Instabilidades genômicas detectadas através de array CGH em fetos com holoprosencefalia

OBJECTIVE: Holoprosencephaly (HPE) is heterogeneous in pathogenesis, integrating genetic susceptibility with the influence of environmental factors. Submicroscopic aberrations may contribute to the etiology of HPE. Our aim was to report the molecular analysis of 4 fetuses with HPE and normal metaphase karyotype. METHOD: A whole genome BAC-array based Comparative Genomic Hybridization (array CGH) was carried out in fetal blood samples. All potential cytogenetic alterations detected on the arrays were matched against the known copy number variations databases. RESULTS: The array CGH analysis showed copy number gains and losses in all cases. We found a recurrent deletion in 15q14 (clone RP11-23J11) and in 15q22 (clone RP11-537k8) in 2 out 4 cases analyzed. We also observed submicroscopic gain in 6p21 in 3 out of 4 fetuses in nearby clones. All these regions were tested in known databases and no copy number variations have been described for them. CONCLUSION: This is the first report of molecular characterization through a whole genome microarray CGH of fetuses with HPE. Our results may contribute to verify the effectiveness and applicability of the molecular technique of array CGH for prenatal diagnosis purposes, and contributing to the knowledge of the submicroscopic genomic instability characterization of HPE fetuses.

OBJETIVO: Holoprosencefalia (HPE) é uma malformação heterogênea na patogênese, integrando a suscetibilidade genética com a influência de fatores ambientais. Aberrações submicroscópicas podem contribuir para a etiologia da HPE. Nosso objetivo foi relatar a análise molecular de 4 fetos com HPE e cariótipo normal. MÉTODO: Foi realizado um estudo descritivo prospectivo dos achados da técnica de hibridação genômica comparativa baseada em microarranjos utilizando BAC clones de ampla cobertura genômica (BAC-array CGH) em amostras sanguíneas de fetos portadores de holoprosencefalia e com cromossomos numericamente normais ao bandamento G. Todas as potenciais alterações citogenéticas detectadas foram comparadas com bancos de dados com variações do número de cópias conhecidas. RESULTADOS: A análise de array CGH evidenciou ganhos e perdas do número de cópias em todos os 4 casos. Foram encontradas deleções recorrentes em 15q14 (clone RP11-23J11) e em 15q22 (clone RP11-537k8) em 2 dos 4 casos analisados. Observou-se em 3 fetos ganho genômico na região 6p21 em clones próximos. Todas estas regiões não apresentaram variações do número de cópias descritas em bancos de dados conhecidos. CONCLUSÃO: Este é o primeiro relato de caracterização molecular através de um microarray CGH de fetos com HPE. Nossos resultados podem contribuir para verificar a eficácia e aplicabilidade da técnica molecular de array CGH para fins de diagnóstico pré-natal, contribuindo para o conhecimento da caracterização de instabilidades genômicas submicroscópicas de fetos com HPE.

Efeito da corticoterapia pré-natal na evolução de recémnascidoscom enterocolite necrosante / Effect of prenatal corticotherapy on the outcome of necrotizing enterocolitis newborns

Objetivos: O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da corticoterapiapré-natal nos resultados pós-natais de recém-nascidos portadoresde enterocolite necrosante. Métodos: Estudo retrospectivo de 173neonatos com diagnóstico de enterocolite necrosante divididos emdois grupos: os que receberam e os que não receberam corticóide noperíodo pré-natal, comparados quanto a alguns parâmetros perinataise de evolução clínica. Resultados: A média do peso foi 1.380,2 g parao grupo 1 e 1.279,5 g para o grupo 2 (p > 0,05); a média da idadegestacional foi 32 semanas para o grupo 1 e 33 semanas para o grupo 2(p > 0,05); a média para o aparecimento dos sintomas foi 16 dias e 12dias, respectivamente (p > 0,05); 26,1% foram Bell III ao diagnóstico nogrupo 1, e 27,9% no grupo 2 (p > 0,05); 39,1% dos neonatos do grupo1 evoluíram para Bell III e 37,5% do grupo 2 (p > 0,05). A complicaçãoclínica mais freqüente em ambos os grupos foi perfuração intestinal.A média do tempo de internação foi 52 dias no grupo 1 e 46 dias nogrupo 2 (p > 0,05). A mortalidade foi de 23,2% para o grupo 1 e 20,2%para o grupo 2 (p > 0,05). Conclusões: Não foi observada associaçãoentre o uso pré-natal de corticóide e melhora na evolução clínica dosrecém-nascidos com enterocolite necrosante.

Fetal rhd genotyping from maternal plasma in a population with a highly diverse ethnic background

OBJETIVO: Avaliar o desempenho da reação em cadeia da polimerase (PCR) em gel (convencional) como método diagnóstico não-invasivo para a genotipagem RHD fetal, por meio da análise do plasma materno. MÉTODOS: Foi conduzido um estudo de validação de teste diagnóstico a partir de 81 amostras sangüíneas obtidas de gestantes brasileiras RhD-negativo, entre 4 e 41 semanas de gestação. As regiões exon 10 e intron 4 do gene RHD foram testadas por meio da reação em cadeia da polimerase alelo-específica (AS-PCR) convencional. Os resultados da genotipagem fetal foram comparados com a tipagem sangüínea convencional no período neonatal. RESULTADOS: Quinze amostras foram obtidas no primeiro trimestre, 37 no segundo trimestre e 29 no terceiro trimestre. Houve falha de amplificação em 6 amostras. A concordância entre os resultados da genotipagem e da tipagem neonatal foi de 97,3%, sensibilidade de 98,3% e especificidade de 93,8%.CONCLUSÃO: AS-PCR convencional é um método com bom desempenho para a genotipagem RHD fetal por meio da análise do plasma materno, mesmo em uma população com alto grau de miscigenação.

Doença hemolítica perinatal: aspectos atuais / Perinatal hemolytic disease: current aspects

Após a introdução e o amplo uso da imunoprofilaxia anti-D, houve um evidente decréscimo na incidência da aloimunização das mulheres de risco nos países desenvolvidos. entretanto, a taxa de incidência tem se mantido constante nos últimos anos, contribuindo de forma significativa para a morbimortalidade perinatal e configurando-se ainda como um desafio para a medicina materno-fetal. A doença hemolítica perinatal é caracterizada por anemia fetal de diferentes graus com sequelas neuropsicomotoras, hidropisia e óbito fetal. Nenhum método propedêutico pré-natal isolado foi altamente indicativo de prognóstico perinatal das gestações complicadas por doença hemolítica perinatal. A transfusão intrauterina é o único tratamento específico disponível atualmente para a doença hemolítica perinatal durante o período pré-natal. A mortalidade perinatal é de cerca de 16 para os fetos não hidrópicos e 58 para os hidrópicos. A tipagem RhD fetal permite a identificação de "fetos de risco" para a doença hemolítica perinatal, e pode ser realizada atualmente no nível molecular. Este artigo faz uma revisão de alguns aspectos da doença hemolítica perinatal, com um breve histórico, fisiopatologia, quadro clínico, aspectos diagnósticos e terapêuticos e atuais avanços, com ênfase na utilização de técnicas da biologia molecular.

Maternal antecedents and outcomes for RHD allo-immunization: a study of a brazilian population

Objetivo: Avaliar a associação entre a evolução perinatal e os antecedentes maternos de eventos sensibilizadores em gestações RhD aloimunizadas, em uma população local. Análise retrospectiva de prontuários médicos de um grupo de gestantes RhD imunizadas, atendidas no Centro de Atenção Integral à Saúde da Mulher da Universidade Estadual de Campinas entre janeiro de 1990 e maio de 1999. As variáveis maternas analisadas foram: passado de hemotransfusão e falta de profilaxia anti-D. Variáveis maternas analisadas foram: passado de hemotransfusão e falta de profilaxia anti-D. Variáveis perinatais: idade gestacional ao parto, peso ao nascimento, transfusão intra-uterina e/ou óbito fetal. A ausência de profilaxia anti-D foi identificada em 70 por cento dos casos. Não houve diferença estátística nas taxas de óbito fetal e necessidade de transfusão intra-uterina entre os grupos de gestantes sem anti-D e o grupo com história de hemotransfusão. A idade gestacional ao parto e o peso ao nascimento nos grupos com e sem hemotransfusão. A idade gestacional ao parto e o peso ao nascimento nos grupos com e sem hemotransfusão foram, respectivamente, 35,7 e 37,9 semanas (p=0,03) e 2232g e 2784g (p=0,04).O antecedente materno mais frequente de causa de aloimunização encontrado na população deste estudo foi a falta de imunoprofilaxia anti-D. A causa da imunização materna não influenciou o prognóstico gestacional, exceto na redução da idade gestacional e no peso ao nascimento nas mulheres com passado de transfusão sanguínea.

Evolução de 58 fetos com meningomielocele e o potencial de reparo intra-útero / Fetal myelomeningocele and the potential in-utero repair: follow-up of 58 fetuses

INTRODUÇAO: O diagnóstico pré natal da meningomielocele (MM) permite melhor planejamento de sua abordagem e, mais recentemente , um possível reparo intra-útero. OBJETIVO: Descrição da evolução perinatal de fetos com MM, acompanhados em um centro de referência em Medicina Fetal, identificando os possíveis fetos candidatos à cirurgia intra-uterina. MÉTODO: Análise retrospectiva descritiva de 58 casos de MM fetal, atendidos no CAISM-UNICAMP, de janeiro de 1997 a dezembro de 2001, identificando-se os casos cuja indicação de cirurgia fetal seria possível. RESULTADOS: Média da idade gestacional ao diagnóstico de 29 semanas (17-39); nível da lesão acima da região sacral em 85 por cento; associação com hidrocefalia em 86 por cento; taxa de complicações cirúrgicas de 39 por cento. Na evolução, 98 por cento apresentaram bexiga neurogênica e 60 por cento deficiência neuro-mental. O potencial reparo intra-útero foi de 42 por cento. CONCLUSAO: MM está associada a graves e frequentes sequelas. Quase um terço dos nossos casos poderiam ter tido a cirurgia fetal como opção terapêutica.

Cariótipo fetal em líquido pleural obtido por toracocentese / Fetal karyotyping of pleural fluid obtained by thoracocentesis

Objetivos: avaliar a efetividade da realizaçäo de cariótipo em líquido pleural obtido por toracocentese de um grupo de fetos portadores de derrame pleural. Métodos: foram avaliados 15 fetos com derrame pleural uni ou bilateral nos quais se realizou uma punçäo da cavidade torácica. A idade gestacional variou entre 19 e 34 semanas. Os fetos foram estudados com ultra-sonografia morfológica para determinar a presença de anomalias associadas. Nos casos em que näo se obteve o cultivo em líquido pleural foi realizada cordocentese para a realizaçäo do cariótipo. O líquido pleural obtido foi enviado para cultura de linfócitos e cariótipo, sendo a técnica de cultivo semelhante à realizada com sangue. Resultados: dos 15 casos estudados foi obtido cariótipo em 12, e destes, em quatro se encontrou a trissomia do cromossomo 21 e os outros 8 foram normais. Em todos os casos, normais ou alterados, o cariótipo foi confirmado no sangue dos recém-nascidos e por meio do exame neonatal ou da necropsia. Näo ocorreram complicações maternas ou fetais relacionadas ao procedimento invasivo...

Conduta obstétrica nas anomalias fetais: revisão da literatura / Obstetric management of fetal abnormalities: literature review

O crescente acesso à ultra-sonografia obstétrica e os recentes avanços tecnológicos dos equipamentos ultrassonográficos têm permitido diagnósticos pré-natais cada vez mais detalhados. Dessa forma, apresenta-se para os obstetras o desafio de conduzir os casos de defeitos congênitos com diagnóstico intra-útero, numa tentativa de preservar a saúde do binômio mãe-feto, indicando a melhor via de parto, no melhor momento para cada caso. No presente trabalho são apresentadas e discutidas as condutas obstétricas em algumas anomalias fetais baseadas em revisão da literatura.

The increasing access to fetal ultrasonography and the recent improvement of ultrasound equipments have been allowed detailed prenatal diagnosis. Thus, obstetricianface the challenge to manage cases of prenatally diagnosed congenital defects, attempting to preserve maternal and fetal healthy by indicating the better delivery way in the better moment for each case. We present in this text the recommendations concerning obstetric management of some fetal abnormalities, based on literature review.